Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital Niño Jesús.

Desde septiembre de 2008 hasta marzo de 2014 un total de 30 muestras de sangre periférica de pacientes ingresados en Cuidados Intensivos con sospecha de SH provenientes de 7 centros diferentes fueron analizadas en paralelo con las de controles sanos emparejados para sexo y edad.

Mediante centrifugación con gradiente de Ficoll se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica, dividiéndose en diferentes alícuotas para los estudios de citometría de flujo y de citotoxicidad.

Mediante citometría de flujo multiparamétrica, utilizando el citómetro Becton Dickinson FACSCanto™ II, se determinó el porcentaje de células NK utilizando la siguiente combinación de anticuerpos: CD3-PE-Cy7, CD16-APC-Cy7 y CD45-FITC de Becton Dickinson, y CD56-APC de Beckman Coulter. Las células NK se definen mediante citometría de flujo como CD45+, CD56+ y CD3−. Se consideró una cifra disminuida de células NK cuando el valor era inferior al 5% de los linfocitos. La degranulación de las células NK se determinó mediante el incremento de la expresión de la proteína CD107a (ΔCD107a) en situación basal y tras estímulo tras al menos 2h de cultivo con la línea celular K562 en las muestras de los pacientes con actividad citotóxica disminuida. Se consideró una degranulación patológica cuando ΔCD107a era inferior al 2%. En la línea celular K562 se determinó la expresión y la intensidad media de fluorescencia de Fas utilizando el anticuerpo Fas-APC de BioLegend.

La determinación de la citotoxicidad de las células NK por fluorescencia resuelta en el tiempo es una técnica no radioactiva, basada en el mismo principio que la técnica convencional de liberación de cromo-5113. Para ello, la línea celular leucémica K562, diana (T por «target») de las células NK por carecer de HLA-I, se carga de éster de acetoximetilo de BATDA, sustancia liposoluble que atraviesa adecuadamente las membranas celulares. Dentro de la célula los enlaces éster son hidrolizados para formar un ligando hidrófilo (TDA) que queda atrapado en el interior de la célula. Posteriormente, y durante 2h, se cocultivan la línea celular con las células mononucleares de sangre periférica donde se encuentran las células NK, los efectores (E). Se establecen diferentes ratios E/T: 8/1, 4/1, 2/1 y 1/1. Las células leucémicas que hayan sido lisadas por las células NK liberarán al sobrenadante el TDA contenido en su interior, que mediante solución de Europio forma un quelante altamente fluorescente y estable (EuTDA). La señal de fluorescencia se midió por triplicado en fluorímetro Tecan Infinite® 200. Se emplearon las siguientes fórmulas para calcular la citotoxicidad específica y espontánea: porcentaje de lisis específica=(lisis experimental−lisis espontánea)/(máxima lisis−lisis espontánea)×100; porcentaje de lisis espontánea=(lisis espontánea−señal de fondo)/(máxima lisis−señal de fondo)×100. Esta medida se correlaciona directamente con la cantidad de células lisadas. La actividad citotóxica se consideró ausente cuando en todas sus ratios sus valores eran iguales o inferiores a 0%, y disminuida cuando en todas sus ratios existía una disminución en comparación con su control sano.

Además de la determinación de la actividad citotóxica NK en situación basal, se realizaron estudios funcionales de citotoxicidad tras estimulación de las células NK con IL-15, R&D Systems, 10ng/ml durante la noche, y bloqueo en las células NK de la proteína de superficie FasL con Anti-human FasL/THFS6 goat IgG, R&D Systems, a una concentración final de 5ng/ml.

Todos los experimentos se realizaron con un control sano de la misma edad. La actividad citotóxica NK se expresó en porcentajes. El aumento de la citotoxicidad NK tras estimulación con IL-15 y la disminución tras el bloqueo de FasL se expresaron en porcentajes respecto a la actividad citotóxica basal. Se realizaron test no paramétricos para determinar las variables epidemiológicas, así como las diferencias entre las medias de la actividad citotóxica en los diferentes grupos. Se consideraron significativas diferencias inferiores a p<0,05.

Un total de 9 pacientes, 6 niños y 3 niñas, fueron diagnosticados de SH primarios (7 formas familiares y 2 pacientes que presentaron reactivación del cuadro hemofagocítico tras suspender el tratamiento, y con actividad NK disminuida persistentemente). Cuatro de los pacientes con formas familiares presentaron mutaciones en PRF-1 –2 con homocigosis y otros 2 con doble heterocigosis–, otro paciente presentó mutación en homocigosis en UNC13D y un polimorfismo en UNC13D, y otro tenía doble mutación en heterocigosis en UNC13D y STXBP2. Un total de 11 pacientes, 7 niños y 4 niñas, fueron diagnosticados de SH secundarios. En estos pacientes los SH fueron secundarios a una infección grave por VVZ en un paciente, 3 estaban asociados a inmunodeficiencias –un paciente tenía enfermedad granulomatosa crónica e infecciones de repetición, otro paciente presentaba síndrome hiper-IgM, y otro, un síndrome de IPEX (ambos cuadros hemofagocíticos aparecieron en el seno de sendas complicaciones postrasplante de progenitores hematopoyéticos alogénico)–, en 3 pacientes aparecieron como complicaciones tras un trasplante multivisceral –2 complicaciones infecciosas y un paciente diagnosticado de linfoma T periférico–, y un paciente mostraba hemimegaencefalia y encefalopatía epiléptica en tratamiento con fármacos antiepilépticos. En 3 pacientes no se encontró causa secundaria.

Un total de 10 pacientes, 5 niños y 5 niñas, no reunieron los criterios suficientes para el diagnóstico de SH. En estos pacientes, los diagnósticos fueron relacionados con infecciones en 5 casos (citomegalovirus, leishmaniasis visceral, sepsis estafilocócica en paciente con histiocitosis de células de Langerhans diseminada, tuberculosis pulmonar en paciente con enfermedad granulomatosa crónica y meningitis de repetición en paciente con síndrome de la hendidura de la notocorda), en 2 pacientes, con anemia de Fanconi, en otro, con encefalitis aguda diseminada autoinmune, y en 2 pacientes no se encontró la causa (fig. 1). La edad mediana de los pacientes fue de 4 años (rango: 2 meses-22 años). No hubo diferencias en la edad entre los diferentes grupos diagnósticos, sin embargo, sí se encontraron diferencias en cuanto al sexo de los niños, siendo tanto los SH primarios como los secundarios más frecuentes en niños que en niñas (tabla 1).

Figura 1.

Algoritmo diagnóstico de nuestra serie de pacientes con sospecha de síndrome hemofagocítico.

(0,23MB).

De los pacientes con SH primario, 7 (77%) recibieron un trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH) alogénico de sangre periférica. En un caso el donante fue un hermano HLA idéntico, en otro caso el donante fue el padre, HLA parcialmente idéntico, en otro caso el donante fue haploidéntico, y en los 4 casos restantes fueron no relacionados HLA idénticos). Un total de 2 (33%) pacientes con diagnóstico de SH primario no pudieron trasplantarse por no presentar remisión clínica del SH. De los pacientes trasplantados, 4 (58%) han fallecido, 2 de ellos por complicaciones derivadas del TPH y 2 por reactivación de la enfermedad, y 3 (42%) pacientes están vivos y sin enfermedad, con quimerismo mixto hematopoyético.

De los pacientes con diagnóstico de SH secundario, 3 (28%) recibieron tratamiento con el protocolo HLH-2004 durante 8 semanas, 5 (45%) recibieron tratamiento con corticoides y/o inmunosupresores, 2 (18%), con antibióticos, y uno (9%), tratamiento quimioterápico para su linfoma. En este grupo han fallecido 2 pacientes (síndrome de IPEX y síndrome de hiper-IgM), en el contexto de sendas complicaciones pos-TPH alogénico por su inmunodeficiencia.

Todos los pacientes con otros diagnósticos recibieron tratamiento adecuado a su sospecha clínica, estando todos vivos.

Todos los pacientes con SH primario y secundario estaban citopénicos. Sin embargo, los porcentajes de células NK variaron entre los diferentes grupos: un paciente (9%) con diagnóstico de SH primario, 5 pacientes (50%) con diagnóstico de SH secundario y 4 (40%) con otros diagnósticos diferentes a SH presentaron un porcentaje de células NK disminuido; estas diferencias fueron estadísticamente significativas (tabla 1). Todos los controles presentaron una cifra normal de células NK. Los ensayos de degranulación se realizaron en los pacientes con actividad NK disminuida, siendo patológica en 3 pacientes (15%). Estas personas posteriormente fueron diagnosticadas de SH primario con mutaciones en homocigosis UNC13D, polimorfismo en UNC13D y doble heterocigosis en UNC13D y STXBP2 (fig. 2).

Figura 2.

Ensayo de degranulación, expresión de CD107a: situación basal, control normal, paciente con diagnóstico genético de mutación en UNC13D (síndrome hemofagocítico familiar tipo 3).

(0,21MB).

En 20 pacientes (67%) se observó una disminución de la citotoxicidad de las células NK en comparación con sus controles (16 vs. 50%, 10 vs. 38%, 5 vs. 28%, 4 vs. 15%) en las diferentes ratios E/T (fig. 3a y tabla 1). Todos estos pacientes fueron diagnosticados de SH. No hubo diferencias entre las formas primarias y secundarias, ni entre pacientes sin diagnóstico de SH y controles sanos.

Figura 3.

Actividad citotóxica de las células NK frente a la línea celular K562 en los pacientes con diagnóstico de síndrome hemofagocítico primario, secundario, sin diagnóstico de síndrome hemofagocítico y sus controles sanos en: a) situación basal, a ratio E/T 8/1, 4/1, 2/1 y 1/1; b) tras estimulación con IL-15, ratio E/T 8:1, y tras el bloqueo de FasL, ratio E/T 8:1, y c) evolución postrasplante, 4 y 6 meses, de la actividad citotóxica de las células NK en 2 pacientes trasplantados con síndrome hemofagocítico familiar tipo 2.

(0,18MB).

En un total de 10 pacientes (33%) la citotoxicidad NK fue normal. Ninguno de estos pacientes fue diagnosticado de SH al no cumplir los criterios diagnósticos.

La estimulación con IL-15 aumentó la actividad citotóxica de las células NK en todos los grupos. Sin embargo, este aumento fue significativamente mayor en los pacientes con formas secundarias respecto a los pacientes con formas primarias, los pacientes sin diagnóstico de SH y los controles sanos (276, 56, 80 y 80%, respectivamente; fig. 3a y tabla 1).

Tras comprobar la expresión de Fas en la línea K562 (fig. 4) se realizaron los experimentos de bloqueo de FasL sobre las células efectoras. El bloqueo de FasL en las células NK disminuyó significativamente la citotoxicidad en los pacientes con diagnóstico de SH primario respecto a los pacientes con SH secundario, los pacientes sin diagnóstico de SH y los controles sanos (48, 15 y 8 y 5%, respectivamente) (fig. 3b y tabla 1).

Figura 4.

Expresión de Fas en la línea celular K562 y FasL en células NK estimuladas con IL-15.

(0,14MB).

En 2 pacientes que recibieron TPH comprobamos, además, cómo la actividad NK se recuperaba progresivamente tras el TPH (fig. 3c). Ambos pacientes presentaban quimerismo mixto hematopoyético.